酶標(biāo)儀的選擇

上海連橋生物科技有限公司

一、濾片Vs光柵

　　多功能酶標(biāo)儀的分類方法眾多，但zui簡單的莫過于用他們的濾光方式來作分界線。一般來說，可以分為濾光片型和光柵型兩大類。當(dāng)然也有一些型號，例如Synergy4和EnVision等，一臺機器里面同時裝上了濾光片和光柵。但是濾片和光柵并不能同時完成同一個檢測，還是想用光柵的時候用光柵，該用濾片的時候用濾片;還有一些實驗非用其中一個不可，另一模塊實現(xiàn)不了的。所以這類儀器本質(zhì)上還只是把濾片和光柵放在了一起，并沒有使兩者糅合而產(chǎn)生新的技術(shù)突破。

　　總體來說，濾片技術(shù)由于發(fā)展已久，配合二向色鏡(其實也就是另一模式的濾光反光濾鏡)等光路系統(tǒng)，可以實現(xiàn)大部分實驗的需要。目前常規(guī)多功能酶標(biāo)儀中高的檢測靈敏度就是用濾光片型做出來的，例如TECAN Infinite F500的熒光檢測的靈敏度可以達(dá)到0.04 fmol/孔(熒光素，384孔/80ul)。

　　但是濾光片型儀器由于受限于濾片的波長和數(shù)量限制，不可能滿足日益增加的實驗類型的檢測需要，而且有時需要對物質(zhì)的吸收、激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行研究，所以后來就誕生了光柵型的儀器。

　　最先推出光柵的是MD公司，其光柵習(xí)慣上稱為單光柵。由于光純度的不足，在光柵的后面又加入了一組帶阻濾片，再把雜光過濾一遍，達(dá)到了5×10^-4的雜光率，基本與純粹的濾光片系統(tǒng)一致。后來TECAN又發(fā)展出了雙光柵技術(shù)，通過兩次光柵濾光，雜光率降到了10^-6。后來，Thermo、BioTek和PE的部分新款儀器等都使用了類似雙光柵技術(shù)。由于激發(fā)和發(fā)射各用了一組雙光柵，此類機器又被稱為四光柵型多功能酶標(biāo)儀。

　　光柵型酶標(biāo)儀的推陳出新，使得用戶在波長選擇上不再受限，而且在雜光率、帶寬控制等性能上還超越了濾光片系統(tǒng)。例如，TECAN公司在2008年底推出使用了第三代四光柵系統(tǒng)的M1000酶標(biāo)儀，雜光率降到了2×10^-7的新低，還實現(xiàn)了帶寬2.5～20nm連續(xù)可調(diào)。這些都是目前濾光片型酶標(biāo)儀所不能或者較難實現(xiàn)的。

　　二、雜光率&波長準(zhǔn)確性

　　光柵型濾光系統(tǒng)儼然已經(jīng)成為了目前通用性多功能酶標(biāo)儀的主流，多家廠家共同努力，已經(jīng)把光柵技術(shù)推到了歷史新高。在光柵的眾多技術(shù)參數(shù)之中，最關(guān)鍵的無疑就是光柵的雜光率和波長選擇的準(zhǔn)確性了。

　　雜光率指得就是光源通過光柵后，得到的光線中，“不需要”的波長的光占所標(biāo)稱波長的光的比例，表征了濾光的純度。由于光線干涉、衍射等的復(fù)雜性，無論使用濾光片還是光柵，雜光都是不可避免的。各種濾光技術(shù)的本質(zhì)就是要想辦法把雜光盡可能地去掉。一般來說，濾光片型的雜光率在10^-4～10^-5之間，光柵型的可以做到10^-6～10^-7。由于此類雜光是非特異的，而且會直接進(jìn)入最后的檢測器，所以有多少的雜光就會引入多少的隨機誤差。在熒光等檢測過程中，由于檢測器存在放大效應(yīng)，雜光率的干擾也會被指數(shù)級放大。因此，雜光率就是一個濾光系統(tǒng)的首要性能指標(biāo)。

　　光柵的另一個重要指標(biāo)就是波長選擇的準(zhǔn)確性。因為很多檢測是依賴于物質(zhì)在某個波長的特征圖譜。就像DNA/RNA的OD260濃度測定，實際檢測波長偏離260nm幾個nm以上的話，OD值與最終濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系就會發(fā)生改變。因此，一組性能優(yōu)良的光柵系統(tǒng)，他的波長選擇準(zhǔn)確性應(yīng)該是在±0.5～1nm之間。波長偏離過大有時就會影響到最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　這兩個可謂是光柵甚至濾光片濾光系統(tǒng)最關(guān)鍵的技術(shù)參數(shù)，直接影響到的是得到數(shù)據(jù)是否是真正所要測量的結(jié)果，是實驗結(jié)果可靠性的最基本要求。

　　三、認(rèn)證>參數(shù)

　　在保證檢測可靠的基礎(chǔ)上，不同儀器的下一個差異就體現(xiàn)在檢測的靈敏度上面，這時人們關(guān)心的就是儀器能夠檢測到多弱的信號。

　　靈敏度涉及了整個光路系統(tǒng)的設(shè)計和選料，很難說某一個部件會起決定性作用。但是有一點，在各種單功能檢測項目中，光吸收檢測用非放大型的光電二極管、熒光檢測用光電倍增管、發(fā)光檢測用專門設(shè)計的單光子計數(shù)光電倍增管，這三種不同的檢測器是各自檢測領(lǐng)域的優(yōu)先選擇。

　　各單項檢測的*結(jié)果都是用相應(yīng)檢測器完成的。當(dāng)然也有的儀器出于成本等考慮，用一個檢測器兼容多種檢測模式，這在一定程度上也能完成實驗需求，但是在性能上也會有所犧牲折中，無法實現(xiàn)各項檢測都達(dá)到*化。

　　關(guān)于靈敏度的定義和檢測標(biāo)準(zhǔn)，每個廠家都有各自的描述，都會說自己是怎樣怎樣好，很難有一個直觀的客觀比較。因此，某些試劑廠家就站了出來，對某些儀器的檢測性能提供一個第三方的認(rèn)證。

　　比較常見的是發(fā)光檢測領(lǐng)域里面的Promega公司DLReady認(rèn)證，熒光檢測領(lǐng)域的Invitrogen公司的LanthaScreen系列認(rèn)證、Cisbio公司的HTRF認(rèn)證、BellBrook實驗室的Transcreener認(rèn)證等等。這些認(rèn)證主要是針對公司提供的某一類型的要求較高的試劑盒，涵蓋了對檢測儀器的各種性能要求，包括：檢測方法是否能用，靈敏度、線性范圍、孔間干擾等是否滿足要求等等。

　　如果需要做相關(guān)的實驗，例如做Luciferase發(fā)光檢測的就看看儀器是否有DLReady認(rèn)證、做TR-FRET的就看看HTRF認(rèn)證、做FP就看看Transcreener認(rèn)證，如果機器擁有相關(guān)的認(rèn)證，就可以說明該機器在一定程度上能夠較好地滿足類似檢測的各種需求，遠(yuǎn)比單單比較一個靈敏度參數(shù)更能說明問題。因為一個實驗?zāi)芊褡龊貌⒉皇菃螁我粋€靈敏度就能表征的。

　　需要特別注意的是，LanthaScreen是一個系列的認(rèn)證，涵蓋了FI、FRET、TRF、FP等多個子項目，不同儀器所通過的子項目是不一樣的，需要上Invitrogen網(wǎng)站仔細(xì)查詢核對。

　　光柵型的儀器由于新技術(shù)近幾年才逐漸興起，受限于技術(shù)研發(fā)和儀器成本，同一個價格范圍內(nèi)的靈敏度等指標(biāo)會略差于發(fā)展成熟的濾光片機器。所以，在中檔多功能酶標(biāo)儀領(lǐng)域，拿到了各種認(rèn)證的光柵型儀器并不多見。而作為新一代光柵型酶標(biāo)儀的代表作，TECAN M1000已經(jīng)拿到了全部上述四種認(rèn)證，而且在靈敏度等單項性能上也已經(jīng)超越了不少的中g(shù)ao端濾片型酶標(biāo)儀。

　　這說明了光柵型酶標(biāo)儀的研發(fā)又進(jìn)入了一個新的高度，除了在靈活性上取得了無可ti代的作用外，還在檢測靈敏度等方面也逐漸替代傳統(tǒng)的濾光片型酶標(biāo)儀。光柵型是科研領(lǐng)域多功能酶標(biāo)儀的未來主要發(fā)展趨勢;而濾光片型儀器也正在往單項性能更優(yōu)的方面改進(jìn)。

　　四、比色杯+微量檢測

除了常規(guī)的6～384/1536孔酶標(biāo)板檢測之外，有些儀器還附帶了比色杯、微量檢測板等的兼容功能。無論是使用立式比色杯、臥式比色杯還是各種微量檢測板，其目的都是給光程不固定的酶標(biāo)板檢測引入一個標(biāo)準(zhǔn)光程的概念。雖然酶標(biāo)板檢測也能通過光程校正等方式實現(xiàn)10mm光程OD值的換算，但這只是一個數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換過程，檢測誤差累積較多，實際使用效果不佳。引入比色杯和微量檢測板后，光吸收的檢測光程就被固定在10mm或者0.5mm等的標(biāo)準(zhǔn)長度，OD值換算更加簡單和準(zhǔn)確。附帶了此類檢測功能的酶標(biāo)儀，相當(dāng)于除了本身的多功能酶標(biāo)檢測之外，還能替代部分分光光度計的功能，使其功能更加全面，儀器的性價比更高。

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